通常情況下，樣本中的糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的濃度很低，很難直接檢測。通過測量酶的底物或產(chǎn)物的變化來確定糖基轉(zhuǎn)移酶(一種添加糖基的酶)或糖苷酶(一種去除糖基的酶)的存在則成為更實(shí)用的方法之一。對于糖基轉(zhuǎn)移酶，底物數(shù)量的減少和酶產(chǎn)物數(shù)量的增加是檢驗(yàn)酶存在和活性的依據(jù)。相反，底物的減少則意味著糖苷酶的存在。通過使用凝集素來跟蹤底物和產(chǎn)物的相對量，可以建立多種檢測方法來監(jiān)測酶的活性。

為了在體內(nèi)特定位點(diǎn)引發(fā)抗炎反應(yīng)，Pagan等人(Ref.9)制備了半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-唾液酸轉(zhuǎn)移酶-IgG融合蛋白作為單一大分子。然后，他們通過將這一重組大分子與供體核苷酸-糖和受體胎球蛋白一起孵育，并使用凝集素印跡監(jiān)測酶產(chǎn)物，來檢測這一融合蛋白是否保留了酶活性。

  精選文獻(xiàn)  

• Determine the activity of recombinantly expressed proteins (Ref. 9)

• Demonstrate the activity and specificity of bacterial enzymes (Ref. 24)

• Verify and validate genetic over- or underexpression systems (Ref. 20)

• Discerning enzymatic presence in novel systems (Ref. 44)

• Monitor glycosylation output after glycosyltransferase manipulation (Ref. 101)

 實(shí)驗(yàn)流程概覽 

樣本制備

• 制備酶樣本；

• 制備酶底物. 通常是活的或固定的細(xì)胞、溶液中的或固定的糖蛋白、溶液中的或固定的純化的糖。

封閉

• 為了減少與底物的非特異性相互作用，可考慮在系統(tǒng)中加入阻斷劑；如：在室溫下，在Vectorlabs的CFB溶液中(Carbo-Free™ Blocking，

SP-5040-125)孵育底物30-60分鐘；

• 用兼容的洗滌緩沖液室溫下清洗兩次(2×)。

反應(yīng)

• 加入含有酶的反應(yīng)緩沖液，糖基轉(zhuǎn)移酶需要核苷酸-糖供體, 糖苷酶則不需要。這兩種酶對pH值和陽離子濃度都非常敏感, 因此需要相應(yīng)地優(yōu)化反應(yīng)緩沖液；

• 將酶與底物輕柔混合孵育；時間和溫度需用戶進(jìn)行優(yōu)化，我們建議以室溫和37°C之間孵育2-4 小時作為起點(diǎn)；

• 盡可能將反應(yīng)物與原材料分離，用兼容的清洗緩沖液室溫下清洗兩次(2×）。

檢測

• 加入熒光標(biāo)記凝集素，室溫下(或4℃條件下孵育過夜)與反應(yīng)物共孵育1小時。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，也可選擇使用生物素標(biāo)記的凝集素；

• 用兼容的洗滌緩沖液室溫洗滌三次(3×)。

顯色

• 如果使用了生物素標(biāo)記的凝集素，此處需加入熒光標(biāo)記鏈霉親和素繼續(xù)孵育；

• 用兼容的洗滌緩沖液室溫洗滌二次(2×)。

信號采集

• 圖像采集，數(shù)據(jù)分析。

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