PUREfrex®是一系列重組無細胞蛋白質合成試劑，重組系統只與轉錄、翻譯相關因素有關，使用者可以根據需要來自由調整反應混合物的成分，由于它只含有已知的蛋白質和底物，因此在下游應用中不必考慮高背景的影響。
什么是PURE？
PURE(Protein synthesis Using Recombinant Elements)系統技術是由東京大學的Takuya Ueda教授發明的重組無細胞蛋白質合成系統。
該反應系統僅由蛋白質、核糖體、氨基酸和NTPs組成。這些蛋白質是轉錄、翻譯、氨酰化和能量再生所必需的。所有的蛋白因子和核糖體都是單獨高度純化的，并在緩沖液中與底物如氨基酸、NTPs和tRNAs組裝。翻譯因子包括: 起始因子IF1/IF2/IF3，延伸因子EF-Tu/EF-Ts/EF-G，釋放因子RF1/RF2/RF3，核糖體再循環因子(RRF)，20種氨酰tRNA合成酶(ARS)，甲硫氨酰tRNA轉移酶。
圖1. PURE(Protein synthesis Using Recombinant Elements)系統技術示意圖
該系統是僅由轉錄和翻譯系統組成的，不像其他使用細胞裂解物的無細胞蛋白質合成系統。該系統沒有未知蛋白質，成分可以隨客戶需要調整。
什么是PUREfrex？
PUREfrex是基于PURE系統技術的產品，該試劑盒主要由3種試劑組成。溶液I包含氨基酸、NTPs、其他小分子化合物和tRNAs。溶液II包含RNA聚合酶、翻譯因子和其他蛋白質。溶液III含有純化的核糖體。將純化的組分以達到最大蛋白質合成活性的濃度混合。對于蛋白質合成，將編碼自己感興趣的蛋白質的DNA(或mRNA)加入到溶液I、II和III的混合物中，然后孵育反應混合物。PUREfrex減少了與蛋白質合成無關的污染物。例如，來自大腸桿菌的脂多糖減少到每ul反應混合物約0.1 EU。核糖核酸酶、β-半乳糖苷酶和其他污染蛋白的量也減少了。PUREfrex試劑中包含的所有翻譯因子和其他蛋白質不包含任何標簽序列。這使得可以使用任何標簽序列來純化和檢測合成的蛋白質。
圖2. PUREfrex與原始PURE系統中污染物比較
PUREfrex®試劑盒總共有3個系列：PUREfrex®1.0；PUREfrex®2.0；PUREfrex®2.1。
PUREfrex®1.0
2011年推出，反應溶液的成分信息是公開的，適用于產品定制等需要明確組成成分信息的研究。雖然使用 PUREfrex® 2.0 合成蛋白時的速度較快，但可能無法及時形成和折疊二硫鍵等導致不溶，此時使用合成速度較慢的PUREfrex® 1.0 效果可能更好。
PUREfrex®2.0
2015年推出，PUREfrex® 2.0改進了從大腸桿菌中純化的所有組分的制備方法，并優化了因子的組成，使PUREfrex 2.0實現了比PUREfrex 1.0高2-10倍的蛋白質生產率。適用于需要合成大量蛋白及多種蛋白的研究。反應液成分信息保密。
PUREfrex®2.1
于2017年推出，在保留PUREfrex® 2.0 反應液組成的基礎上，單獨添加了還原劑，因此可根據添加的還原劑（和氧化劑）種類和數量來調整合成過程中的氧化還原狀態。適用于需嚴格控制氧化還原狀態的含二硫鍵結合的蛋白合成。
圖3.PUREfrex® 1.0和PUREfrex® 2.0對比數據
圖4.PUREfrex®2.0和PUREfrex®2.1成分對比
產品信息
產品名稱 | 產品貨號 | 規格 |
PUREfrex® 1.0 | GFK-PF001-0.25-EX | 1 x 250 µl |
GFK-PF001-2ML-EX | 2 ml | |
GFK-PF001-10ML-EX | 5 x 2 ml | |
PUREfrex® 2.0 | GFK-PF201-0.25-EX | 1 x 250 µl |
GFK-PF201-2ML-EX | 2 ml | |
GFK-PF201-10ML-EX | 5 x 2 ml | |
PUREfrex® 2.1 | GFK-PF213-0.25-EX | 1 x 250 µl |
GFK-PF213-2ML-EX | 2 ml | |
GFK-PF213-10ML-EX | 5 x 2 ml |
應用
使用PUREfrex®可合成各種活性蛋白，包括原核蛋白、真核蛋白、膜蛋白、含二硫鍵的蛋白質、含非天然氨基酸的蛋白質。PUREfrex®可用于以下研究領域，適用于各種蛋白質的小規模、高通量合成，也是蛋白質功能評估的機器學習平臺的理想選擇。
1. 核糖體展示技術
2. mRNA展示技術
3. 蛋白翻譯機制研究
4. 蛋白質合成后的折疊
蛋白合成添加劑
根據您的蛋白質的性質，可以選擇不同的添加劑，添加到PUREfrex®試劑盒中，改善蛋白的折疊和溶解性。
1.分子伴侶
分子伴侶像hsp70（如E. coli DnaK）有助于合成蛋白質的正確折疊。由于PUREfrex®試劑盒不含任何分子伴侶，一些蛋白質可能難以形成正確的構象，合成后為不溶性。在這種情況下，添加分子伴侶可能有助于增加溶解性和活性。
產品貨號 | 產品名稱 | 規格 | 描述 |
GFK-PF003-0.5-EX | DnaK Mix | 500 µl Equivalents | 高度純化的大腸桿菌來源的DnaK、DnaJ、GrpE蛋白以適當的濃度比例預混后的溶液 |
GFK-PF003-10ML-EX | DnaK Mix | 5 x 2 ml Equivalents | |
GFK-PF004-0.5-EX | GroE Mix | 500 µl Equivalents | 經高度純化的大腸桿菌來源的GroEL、GroES蛋白以適當的濃度比例預混后的溶液 |
GFK-PF004-10ML-EX | GroE Mix | 5 x 2 ml Equivalents |
2.形成二硫鍵
對于某些蛋白質，如分泌蛋白，二硫鍵的形成對其穩定性或活性很重要。二硫鍵通常是由相鄰半胱氨酸殘基的巰基（SH-）氧化形成的。因此，氧化環境是形成二硫鍵所必需的。此外，二硫鍵異構酶（如E. coli DsbC）可以催化二硫鍵交換，也是形成半胱氨酸正確配對所必需的。
產品貨號 | 產品名稱 | 規格 | 描述 |
GFK-PF005-0.5-EX | DsbC Set | 500 µl Equivalents | 含有作為氧化谷胱甘肽（GSSG）和二硫鍵異構酶的大腸桿菌 DsbC |
GFK-PF005-10ML-EX | DsbC Set | 5 x 2 ml Equivalents | |
GFK-PF006-0.5-EX | PDI Set | 500 µl Equivalents | 含有氧化谷胱甘肽（GSSG）、人源二硫鍵異構酶（PDI）和PDI的氧化酶Ero1α |
GFK-PF006-10ML-EX | PDI Set | 5 x 2 ml Equivalents |
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