我的實驗樣本可以用于CUT&RUN嗎? 四大因素需考量

CUT&RUN技術使用完整的細胞或細胞核來繪制組蛋白翻譯后修飾（PTMs）和染色質相關蛋白（如轉錄因子）的全基因組富集圖譜。在EpiCypher，客戶經常會問，“我的細胞樣本適用于CUT&RUN技術嗎? "盡管大家希望所有細胞都可以表現出理想的適用性，但事實并非如此。

在這里，我們將討論EpiCypher在評估CUT&RUN實驗中細胞使用的主要標準。通常情況下，不理想的樣本質量=不理想的CUT&RUN數據。

1.細胞數量

為了獲得可靠精準的實驗數據，EpiCypher建議在CUT&RUN實驗中每個反應使用500,000個細胞。在實驗過程中，我們分兩次對細胞進行計數：第一次是在最初的細胞采集時，第二次是將細胞固定在磁珠上之前。第二次計數的目的是確保在使用CUT&RUN緩沖液洗滌過程中沒有大量細胞樣本的丟失或細胞裂解的發生。有關具體指導信息，請點擊技術支持中心了解詳情。

CUTANA™ CUT&RUN成功將選定的目標細胞數減少到5000個。需要注意的是，使用較低的細胞數可能會降低CUT&RUN產量，所以需要據此對文庫制備和測序進行調整。如果出現這些情況，請點擊CUT&RUN Library Prep Kit手冊以獲得實用建議。

2.細胞活力

EpiCypher在細胞收獲時就會測定細胞活力或“活細胞"的百分比。初始細胞的活力對于CUT&RUN實驗的成功至關重要。低活力可能導致分析背景增加、產量降低以及在實驗過程中細胞/磁珠出現聚集的問題。

值得注意的是，細胞的最佳活力高度依賴于樣本類型。例如，用于CUT&RUN實驗的K562細胞我們要求在培養收獲時有>90%的活力。然而，對于其他某些樣品類型或實驗條件，細胞的最佳活力可能較低。

關于細胞活力和細胞計數方法的小提示

EpiCypher建議使用簡單的臺盼藍染色方法來計數細胞并確定初始細胞活力。因為臺盼藍染料對細胞有毒，所以在添加染料后一定要立即計數。

有些細胞對臺盼藍高度敏感。如果細胞在臺盼藍染色時顯示出較低的活力，但在培養過程中具有預期的形態、最小的裂解度且能正常生長，那么這些細胞可能適用于CUT&RUN技術。對此，我們建議使用濃度更低的臺盼藍染料或嘗試其他細胞計數方法（如碘化丙啶）來確認細胞活力。

3.細胞形態和完整性

CUT&RUN技術需要形態正常的完整細胞。形態是指細胞形狀，與組織來源和/或細胞在培養基中的生長方式有關。懸浮細胞，如K562細胞，通常來源于血細胞和/或腫瘤細胞，具有圓形和對稱的形態。由于貼壁細胞可以來源于上皮、內皮、神經元或成纖維細胞組織，因此表現出不同的形態和擴增特征。例如，上皮細胞往往具有均勻的細胞形狀，可以在細胞培養板上成片生長，而成纖維細胞表現出不對稱、細長的形態，可用于研究細胞遷移。

使用裂解或質量差的細胞也會導致數據質量低。為了確保有效的樣品制備，EpiCypher在初始細胞采集和磁珠結合之前均會檢查細胞形態和細胞膜的完整性。第二次檢查很重要，因為一些樣品類型（例如FACS分離的細胞或來自組織的細胞）可能對CUT&RUN洗滌緩沖液中的裂解成分更敏感。在這些情況下，我們建議在進行CUT&RUN實驗時分離細胞核（Figure 1）。

Figure 1: Successful isolated K562 cell nuclei. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.

4.細胞來源注意事項：細胞系、原代細胞、組織和干細胞

細胞的形態、活力和數量會直接受到細胞來源的影響。CUT&RUN實驗使用的細胞可以來自組織、細胞系、培養的原代細胞或通過其他方式純化的細胞（例如FACS）。下面我們將討論這些細胞樣本的優勢和面臨的挑戰。

√ 永生化細胞系

示例：HEK293、HeLa、K562、NIH/3T3、MCF-7（Figure 2）、H1299（Figure 3）、A549和THP-1細胞系。

優點：一般來說，細胞系是CUT&RUN技術中最容易優化的input。細胞系可以提供：

● 大量具有高活力的細胞——CUT&RUN實驗成功的關鍵。

● 精準且可高度重復的CUT&RUN實驗結果——源于細胞系的同質性。

● 用于藥物篩選、基因過表達/抑制等的強大系統——不會破壞樣本質量。

缺點：細胞系的使用有很多注意事項，概述如下。而根據實驗目的，細胞系可能是最佳的來源選擇。

● 一般來說，細胞系不能代表體內條件。它們通常來源于腫瘤細胞或其他病變細胞群，與原代細胞相比，它們的功能可能不同。

● 細胞系容易發生基因組改變，包括染色體異常、重復和/或遺傳漂移。

● 被其他細胞系污染很常見。錯誤細胞系的鑒定結果可能會妨礙測定的重現性，并導致錯誤的生物學結論。

Figure 2: MCF-7 breast cancer cells in culture. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.

√ 原代細胞

示例：來源于活體組織樣品，固體（如腸、肺、肝、皮膚）或液體（如血液），經過或未經過細胞培養的均可。

優點：原代細胞經常用于CUT&RUN，因為研究者使用它們可以：

● 探究在天然異質的細胞環境中染色質的功能和生物學機制。

● 研究通過FACS或其他技術分離的稀有細胞的功能狀態。

● 確定細胞對體內刺激或藥物治療的反應。

● 表征患者樣本（例如腫瘤VS.健康細胞）。

缺點：原代細胞的缺點取決于研究的組織和細胞類型。在研究原代細胞時，可能面臨的挑戰有：

● 分離足夠數量的細胞——在分離過程中細胞的敏感性（如FACS）或在組織中的低豐度。

● 獲得具有高活力的細胞——原代細胞通常需要小心處理以防發生裂解。

● 擴大培養——原代細胞在培養基中的生長能力通常僅限于幾個階段，需要仔細規劃并優化實驗時間表。

● 獲得一致的實驗結果——特別是來源于含有許多不同細胞類型的大塊組織。

Figure 3: H1299 non-small cell lung carcinoma cells in culture. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.

√ 干細胞

示例：誘導多能干細胞（iPSCs）、間充質干細胞和胚胎干細胞。

優點：生長和培養多能干細胞群和成體干細胞群的功能使以下研究成為可能：

● 研究細胞發育、分化和疾病發展過程中的表觀遺傳學變化。

● 生成用于功能分析和治療開發的稀有細胞類型。

● 開發用于個性化醫療應用的患者特異性細胞群。

● 使用二維細胞和/或類器官培養研究細胞的生長和分化。

缺點：盡管干細胞在細胞和基因治療研究以及發育生物學方面有前景，但干細胞的研究在許多方面都面臨挑戰：

● 干細胞培養需要豐富的經驗，即便如此，擴增某些干細胞群也很困難。

● 培養干細胞需要多種質控措施和精確的監測，成本高且耗時。

● 不同研究人員之間的分化方案可能會有所不同，從而引入意想不到的偏差和變化。

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EpiCypher是一家成立于2012年的表觀遺傳學公司。從專有組蛋白肽陣列平臺EpiGold™開始，EpiCypher開發了一系列同類產品。同時，EpiCypher是重組核小體制造和開發的全球領-導者。利用其獨-有技術，不斷增加產品庫中高純度修飾重組核小體（dNucs™）產品。dNuc™多樣性的產品為破譯組蛋白編碼和加速藥物開發提供了強大的工具。

EpiCypher還將dNuc™技術廣泛的應用于多種分析測定產品中，包括：SNAP-ChIP®Spike-in Controls（用于抗體分析和ChIP定量）， EpiDyne®底物（用于染色質重塑和抑制劑篩選及開發），dCyher™測定（用于探究表觀遺傳蛋白質-組蛋白PTM結合相互作用）。最近，EpiCypher還推出了針對ChIC、CUT&RUN和CUT&Tag的高靈敏度表觀基因組圖譜CUTANA™分析。

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